Uma serina protease citotóxica putativa de Salmonella typhimurium UcB5 recuperada de hambúrguer mal cozido

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 3926 (2023) Citar este artigo

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Uma exoprotease de virulência putativa designada como UcB5 foi purificada com sucesso da bactéria Salmonella typhimurium para a homogeneidade eletroforética com 13,2 vezes e 17,1% de recuperação por cromatografia hidrofóbica, de troca iônica e de permeação em gel usando Phenyl-Sepharose 6FF, DEAE-Sepharose CL-6B , e Sephadex G-75, respectivamente. Aplicando SDS-PAGE, o peso molecular foi confirmado em 35 kDa. A temperatura ótima, pH e ponto isoelétrico foram 35 °C, 8,0, 5,6 ± 0,2, respectivamente. Verificou-se que UcB5 tem uma ampla especificidade de substrato contra quase todos os substratos cromogênicos testados com afinidade máxima contra N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA atingindo Km de 0,16 mM, Kcat/Km de 3,01 × 105 S-1 M −1, e atividade amidolítica de 28,9 µmol min−1 L−1. Foi drasticamente inibido por TLCK, PMSF, SBTI e aprotinina, enquanto DTT, β-mercaptoetanol, 2,2'-bipiridina, o-fenantrolina, EDTA e EGTA não tiveram efeito, o que sugeriu um tipo de serina protease. Além disso, mostrou uma ampla especificidade de substrato contra uma ampla gama de proteínas naturais, incluindo proteínas séricas. Um estudo de citotoxicidade e microscopia eletrônica revelou que UcB5 poderia causar proteólise subcelular que finalmente levou à necrose hepática. Para isso, pesquisas futuras devem se concentrar no uso de uma combinação de antiproteases externas e agentes antimicrobianos para o tratamento de doenças microbianas, em vez de usar drogas isoladamente.

Toxinas e enzimas operam como agentes de virulência chave na patogênese microbiana dentro dos hospedeiros doentes1,2. As toxinas bacterianas estão totalmente caracterizadas e seu papel no processo de patogênese é bem estudado, enquanto o papel das proteases microbianas na patogênese de animais e plantas não é bem estudado. Isso pode ser resultado da complexidade das enzimas e da falta de seletividade em comparação com as toxinas3. As proteases foram identificadas há muito tempo nos extratos celulares de muitas bactérias patogênicas4. Pode ser uma surpresa saber que a maioria deles não foi identificada por muito tempo e só foi completamente definida recentemente. Os micróbios produzem muitos tipos de proteases categorizadas como tipos serina, metalo, aspártico e cisteína. Alguns deles são especificamente inibidos por inibidores de proteases plasmáticas conhecidos como serpinas, enquanto a maioria deles são resistentes ou inativam antiproteases plasmáticas humanas. Como resultado, uma vez dentro, eles acelerarão o processamento da doença e o comprometimento do hospedeiro5.

Seu envolvimento na virulência tem sido associado a uma variedade de métodos. Para iniciar o processo de invasão ou digerir as proteínas do hospedeiro para acessar os nutrientes peptídicos, eles primeiro proteolizam e destroem o tecido do hospedeiro. Por exemplo, ao interferir com proteínas de sinalização celular ou proteínas proteolíticas dos componentes da matriz, a protease HtrA facilita a disseminação de doenças primeiro. Em segundo lugar, eles podem ativar toxinas de subunidades (toxinas AB) dividindo a porção ativa (subunidade A) da porção de ligação (subunidade B). Em terceiro lugar, algumas delas, como as proteases Clp e Lon, atuam dentro do citosol diretamente pela destruição oportuna dos controladores de virulência e indiretamente, fornecendo resistência aos componentes antagonistas internos, como superóxidos e radicais livres, para impedir os componentes efetores imunológicos do hospedeiro contra os agentes infecciosos. patógeno bacteriano6.

S. enterica com mais de 2.000 sorovares pode causar muitas doenças diferentes. Os sorovares Enteritidis e Typhimurium são a causa mais comum de gastroenterite em humanos, enquanto outros sorovares como S. typhi são a causa fundamental de doenças sistêmicas fatais. Curiosamente, os mutantes do serovar Typhimurium sem as proteases clpP ou clpX são cepas não virulentas, indicando a importância da protease ClpXP na salmonelose7. Além disso, os sorovares mutantes sem Lon protease são altamente sensíveis ao H2O2 e à acidez, portanto incapazes de persistir no interior de macrófagos e proliferação em partes distais do corpo para iniciar doenças8. Verificou-se que a peptidase N do sorovar Typhimurium é a principal aminopeptidase dentro de citosol com uma ampla gama de atividade de substrato9.