Reconstituição da biossíntese de alcaloides indólicos monoterpênicos em Nicotiana benthamiana manipulada pelo genoma

Biologia das Comunicações volume 5, Número do artigo: 949 (2022) Cite este artigo

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Os alcalóides indólicos monoterpênicos (MIAs) são uma classe diversificada de produtos naturais de plantas que incluem vários compostos medicinalmente importantes. Nós nos propusemos a reconstituir a via para a estritosidina, um intermediário chave de todos os MIAs, do metabolismo central em Nicotiana benthamiana. Uma desvantagem deste hospedeiro é que seu rico metabolismo de fundo resulta na derivatização de algumas moléculas produzidas de forma heteróloga. Aqui usamos análise transcriptômica para identificar glicosiltransferases que são reguladas positivamente em resposta a intermediários biossintéticos e produzem linhas de plantas com mutações direcionadas nos genes que as codificam. A expressão da via inicial do MIA nessas linhas produz um perfil de produto mais favorável. A biossíntese da estritosidina foi reconstituída com sucesso, com os melhores rendimentos obtidos pela co-expressão de 14 enzimas, das quais uma importante enzima semelhante à proteína do látex (MLPL) de Nepeta (catmint) é crítica para melhorar o fluxo através da via iridóide. A remoção de glicosiltransferases endógenas não afeta os rendimentos de estritosidina, destacando que o fluxo metabólico das enzimas da via para um intermediário biossintético estável minimiza a necessidade de manipular o metabolismo endógeno do hospedeiro. A produção de estritosidina in planta expande a gama de produtos MIA passíveis de síntese biológica.

A aplicação de abordagens de biologia sintética para sistemas de plantas de engenharia facilitou avanços no controle e expressão de vias biossintéticas, permitindo que as plantas sirvam como um chassi alternativo de produção bioquímica1,2. Um parente do tabaco, N. benthamiana3,4 emergiu como uma espécie favorecida para a produção vegetal de proteínas farmacêuticas5 e reconstituição da via metabólica2. Os sucessos incluem a produção em escala de gramas de triterpenoides6 e a produção em escala de miligramas de etoposídeos7. No entanto, vários estudos relataram o acúmulo de produtos colaterais não intencionais, presumivelmente produzidos pelas atividades fora do alvo de enzimas endógenas de N. benthamiana, como oxidases e glicosiltransferases8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18. Embora a atividade de enzimas endógenas tenha sido explorada em alguns estudos para produzir novas moléculas9 ou para compensar a falta de uma enzima conhecida19, a derivatização de moléculas na maioria das vezes é uma desvantagem, reduzindo o potencial de pureza e rendimento do composto alvo.

Os alcaloides indólicos monoterpênicos (MIAs) são um grande grupo de produtos naturais produzidos por plantas, dos quais mais de 3.000 foram identificados20. Esta classe de moléculas inclui muitos compostos medicinalmente valiosos usados ​​para tratar vícios, problemas cardíacos, demência, dor, câncer, malária e diabetes. A planta produtora de MIA melhor caracterizada é a Catharanthus roseus (pervinca de Madagascar), que produz mais de 130 MIAs, incluindo os bioativos vinblastina e vincristina, que são usados ​​como quimioterapias. No entanto, essas moléculas valiosas estão presentes em baixas concentrações em C. roseus (0,0005% do peso seco)21, o que limita sua disponibilidade. O cultivo em massa de células C. roseus é viável, mas ainda não foi relatada uma linha celular que produza consistentemente essas moléculas anticancerígenas22. Embora tenham sido relatados métodos para expressão transiente23 e transformação genética estável24 de plantas C. roseus, a engenharia genética da planta hospedeira nativa para aumentar os rendimentos desses compostos permanece tecnicamente difícil. Além disso, a complexidade estrutural de muitos MIAs significa que a síntese química é frequentemente desafiadora25,26. Consequentemente, rotas alternativas de produção são desejáveis ​​e a recente descoberta de etapas ausentes na via da vimblastina27,28 torna a reconstrução da via em um hospedeiro heterólogo uma opção cada vez mais atraente.

Alcançar a produção de quantidades terapeuticamente úteis de MIAs requer engenharia de via para maximizar o fluxo metabólico através das partes iniciais da via. A estritosidina é o último intermediário biossintético comum do qual derivam todos os mais de 3.000 MIAs conhecidos. A reconstituição de sua via biossintética de ~11 etapas em microrganismos pode exigir um ajuste extensivo das condições de expressão enzimática e otimização da cepa29, por exemplo, a expressão pobre de geraniol 8-hidroxilase (G8H) prejudicou a produção de estritosidina em levedura30. A obtenção de rendimentos úteis de moléculas como a vinblastina, que exigiria a expressão de mais 16+ enzimas além da estritosidina, provavelmente exigirá uma engenharia substancial, embora a levedura tenha sido recentemente projetada para produzir ajmalicine por meio da integração genômica de 29 cassetes de expressão, demonstrando a potencial para reconstrução heteróloga de esforços de vias biossintéticas de produtos naturais de plantas31.